创新是驱动生物医药产业迈向新质生产力发展的核心引擎。细胞和基因治疗领域，不仅是技术进步的显著标志，更是医药领域的一场深刻变革。作为创新医疗技术的典范——细胞治疗产品及技术，自1990年Thomas医生因骨髓移植研究荣获诺贝尔奖以来，已逐步从实验室步入临床应用阶段，为患者带来治疗的新希望[1]。

细胞治疗产品的种类繁多，基于目前的技术，主要包括人源干细胞及其衍生细胞治疗产品、免疫细胞治疗产品及经基因修饰/改造的细胞治疗产品等；根据供体来源不同可分为自体、同种异体和异种细胞等[1,2]。

与传统药物相比，细胞治疗产品的作用机制及体内过程均存在明显不同。细胞治疗产品进入体内后通常不经历典型的吸收、分布、代谢和排泄过程，如免疫细胞进入体内后一般经历分布、增殖、耗竭等过程。细胞治疗产品的体内过程是影响有效性和安全性的重要因素，应根据具体产品采用适宜的分析方法考察细胞动力学特征[2,3]。目前对于细胞治疗产品的细胞动力学分析通常采用流式细胞术，qPCR或者数字PCR（dPCR）的检测方法。qPCR/dPCR相较流式细胞术具有更高的灵敏度，另外qPCR/dPCR进行细胞治疗产品的定量分析时，主要是通过检测产品的特异性靶序列的拷贝数达到定量分析目的。但是对于未经基因修饰/改造的细胞治疗产品，由于缺乏特异性的靶序列，故其定量分析方法存在较大的挑战。

解决方案：基于InDel标记的dPCR 检测panel

针对未经基因修饰/改造的同种异体细胞治疗产品，益诺思建立了一个通用的dPCR检测panel，可用于该类产品的临床细胞动力学分析。针对该类产品，我们首先设计了InDel标记文库，然后基于该文库设计并筛选了多对引物探针组合，最终建立了一个dPCR检测panel，目前该通用型dPCR检测panel正在专利申请中。

该dPCR检测panel利用InDel标记的优势，如稳定性好、多态性高，且在基因组中分布广泛、密度大、数目众多等优势，具有覆盖范围广、灵敏度高的特点，为该类产品临床研究中的细胞动力学研究提供了一套普适通用高灵敏度的解决方案。

益诺思生信团队基于人类基因组数据库建立了一个InDel分子标记文库，该InDel分子标记文库包含选自人染色体上的InDel位点中的一种或多种，可以达到99%以上的人群覆盖率。

在未经基因修饰/改造的同种异体细胞治疗产品的细胞动力学分析中，使用该dPCR检测panel筛选出该受试者的特异性引物探针对：通过对比供体细胞（细胞治疗产品）与受试者的基因组，选择出在供体细胞（细胞治疗产品）中存在，而在受试者中缺失或插入的InDel位点（纯合插入或纯合缺失），该位点即可作为该受试者的特异性检测靶标，用于细胞动力学分析。

数字PCR是一种能够对待测样本进行绝对定量的核酸分析技术。它将一个传统PCR反应分割成数万个纳升级的微滴，每个微滴作为独立的反应单元，含有零个、1个或多个目标序列，通过计数阳性微滴的比例，利用泊松分布统计原理，直接计算出目标序列的绝对拷贝数（如图1所示[6]）。数字PCR技术无需依赖标准曲线，具有灵敏度高，绝对定量，耐受性高等优势。

图1 数字PCR基本原理[6]

益诺思已成功开发了一个通用的dPCR检测panel，涵盖多个InDel检测位点，在临床研究中，可从该panel中筛选出至少1对引物探针用于细胞动力学分析，该检测方法无须依赖标准品即可进行绝对定量，实现未经基因修饰/改造的同种异体细胞治疗类产品临床样本的细胞动力学分析。

使用该dPCR检测panel筛选特异性InDel检测引物探针对流程：首先提取供体细胞（细胞治疗产品）和受试者基因组DNA，分别进行该dPCR检测panel筛选，选择在供体细胞（细胞治疗产品）中阳性（图2中深色标识），而在受试者中阴性（图2中浅色标识），该位点即可作为该受试者的特异性检测靶标，用于细胞动力学分析（如图2所示）。益诺思已使用该检测panel筛选了多对供体受体对，下表为其中一对供体受体对的实际筛选结果展示。下表为30个InDel位点的筛选结果，有6个InDel位点（InDel-1、InDel-8、InDel-12、InDel-22、InDel-25、InDel-28）可作为检测靶标用于后续定量分析。

图2 dPCR检测panel检测流程示意图

表1 个体1为供试者，个体2为受试者

备注说明：dPCR检测panel中InDel位点检测阳性用“1”表示，阴性用“0”表示

该dPCR检测panel具有如下优势：

• 普适性：为未经基因修饰/改造的同种异体细胞治疗产品提供了通用的临床细胞动力学分析方案。

• 稳定性：InDel检测位点存在于基因组DNA中，随细胞分裂稳定遗传，不易降解。

• 绝对定量：dPCR方法无需标准品，可以直接输出拷贝数。

• 高灵敏度：dPCR方法能够稳定检测低至0.01%的突变率靶标，检测灵敏度可低至5copies/反应，可捕捉微量存续的细胞。

• 高耐受性：dPCR方法对样本中PCR抑制物具有高耐受性，尤其适合处理复杂的临床样本。

该dPCR检测panel为同种异体细胞治疗产品尤其是未经基因修饰/改造的细胞治疗产品的临床细胞动力学分析，提供了一种有效、可靠、通用、高灵敏度的检测方法和解决方案，为优化治疗方案、评估安全性和解释疗效提供了至关重要的支持。

参考文献：

1.朱凤昌,叶潇,崇小萌,等.国际细胞治疗临床研究发展现状及监管政策研究[J].中国药物评价, 2024, 41(4):257-264.

2.细胞治疗产品临床药理学研究技术指导原则（试行），2024年11月.

3.免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行），2021年2月.

4.杨洁,赫佳,王丹碧,等.InDel标记的研究和应用进展[J].生物多样性, 2016, 024(002):237-243.

5.Tanja, Stahl, et al. "Digital PCR Panel for Sensitive Hematopoietic Chimerism Quantification after Allogeneic Stem Cell Transplantation." International Journal of Molecular Sciences 17.9(2016):1515.

6.Trouchet, Amandine et al. “Digital PCR: from early developments to its future application in clinics.” Lab on a chip vol. 25,16 (2025): 3921-3961.

7.Wissel, Mark et al. “Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC.” Bioanalysis vol. 14,12 (2022): 853-863.