在肿瘤治疗领域，病毒疗法的研究已跨越百年。自 19 世纪首次受到关注以来，其发展曾因技术壁垒与安全隐患陷入瓶颈，直到近 20 年才迎来突破性进展。如今，病毒在肿瘤治疗中的应用主要分为基因治疗病毒载体和溶瘤病毒（oncolytic viruses, OVs）两大方向，其中经基因修饰的溶瘤病毒，凭借 “精准攻击肿瘤” 的独特优势，成为肿瘤免疫治疗的核心研究热点。

目前，溶瘤病毒已从基础研究走向临床应用，全球批准的溶瘤病毒产品，用于晚期鼻咽癌、黑色素瘤、膀胱癌、胶质母细胞瘤的治疗；给药方式也从单一瘤内注射拓展至膀胱灌注等局部给药模式，为不同肿瘤患者提供了差异化治疗选择。

而随着技术迭代，溶瘤病毒的未来更值得期待：在基因工程领域，科学家正通过 “病毒衣壳改造” 降低预存抗体识别率 —— 例如对腺病毒衣壳蛋白进行定点突变或表面修饰，既保留病毒的肿瘤靶向性，又减少与体内预存抗体的结合，从源头削弱免疫原性干扰；同时，“武装型溶瘤病毒” 研发持续推进，未来的溶瘤腺病毒不仅能直接溶解肿瘤细胞，还可携带更丰富的 “免疫调节基因”（如 PD-1/PD-L1 抑制剂、双特异性抗体基因等），在杀伤肿瘤的同时打破免疫抑制微环境，实现 “溶瘤 + 免疫治疗” 的双重协同效应。

溶瘤病毒疗法的双重作用机制通路：PAMPs 和 DAMPs

图源：《Oncolytic Viruses: From Basics to Challenges to Innovation》

溶瘤病毒的核心能力，是能选择性感染肿瘤细胞—— 在肿瘤细胞内大量复制，最终 “溶解” 肿瘤细胞，同时对正常细胞几乎无损伤。不仅如此，通过基因工程改造，溶瘤病毒还可携带自杀基因、细胞因子等 “增效模块”，进一步强化溶瘤效果或激活机体抗肿瘤免疫反应。目前，腺病毒、反转录病毒、单纯疱疹病毒等多种病毒已被改造为条件复制型溶瘤病毒，其中溶瘤腺病毒因其高效的肿瘤选择性复制能力、成熟的规模化生产工艺、可装载大片段外源基因的特性，成为当前研究最深入、应用最广泛的溶瘤病毒平台之一。

已批准上市OVs产品

来源：《Formulation-optimized oncolytic viruses: Advancing systemic delivery and immune amplification》

尽管溶瘤腺病毒优势显著，但其临床应用仍面临一大关键挑战—— 免疫原性。根据 NMPA《溶瘤病毒类药物临床试验设计指导原则（试行）》，溶瘤病毒的中和抗体可能干扰病毒在体内的分布，而机体对病毒的 “预存免疫”（包括体液免疫和细胞免疫）会直接影响给药途径、剂量及次数，因此必须密切监测机体对溶瘤病毒及表达产物的免疫反应。

腺病毒的免疫原性问题尤为突出：作为自然界中最常见的人类病毒之一，5 型人腺病毒在中国人群中的预存抗体阳性率高达 70%~80%。这些预存抗体或治疗后新产生的抗体，可能与溶瘤腺病毒结合，降低病毒的肿瘤靶向性和复制能力，进而削弱治疗效果，甚至导致后续给药失效。

因此，溶瘤腺病毒的免疫原性分析需重点关注三大方向：预存抗体水平、病毒本身的体液 / 细胞免疫反应、病毒表达产物的体液 / 细胞免疫反应。下文将聚焦体液免疫原性分析，详解检测平台与核心方法。

根据 FDA 和 NMPA 的指导原则，抗药抗体（Anti-Drug Antibody, ADA）的检测需遵循 “多层级分析策略”：先通过筛选试验排查所有样本，再对疑似阳性样本进行特异性确证，随后测定阳性样本的抗体滴度，最后检测抗体的中和活性（即中和抗体，Neutralizing Antibody, NAb）。以下分模块解析溶瘤腺病毒及表达产物的体液免疫检测方法。

抗药抗体（ADA）检测

1. 抗药抗体（ADA）检测

ADA 检测的核心是识别样本中针对 “溶瘤腺病毒本身” 或 “病毒表达蛋白” 的抗体，常用酶联免疫吸附法（ELISA）或电化学发光法（ECLIA）。

1.1.针对溶瘤腺病毒的 ADA 检测

采用包被有完整/灭活腺病毒（ADV）的 96 孔板，加入一定稀释倍数的患者血清，使用标记后的病毒衣壳或抗人 IgG 抗体进行检测，通过信号判断抗体是否存在。

由于溶瘤腺病毒的预存抗体率高，单纯判断“阳性 / 阴性” 意义有限，因此通常通过比较给药前后的抗体滴度变化，评估机体是否因治疗产生新的 ADA 或原有抗体水平升高。

腺病毒的ADA分析示意图

1.2. 针对病毒表达蛋白的 ADA 检测

若溶瘤腺病毒携带外源基因（如 Nadofaragene firadenovec 的 IFN-α 2b 基因），需额外检测针对 “表达蛋白” 的 ADA。此类检测采用桥联检测体系：将 “药物（表达蛋白）” 与 “标记后的药物” 作为捕获试剂和检测试剂，若样本中存在抗表达蛋白的 ADA，可同时结合两种试剂形成 “药物 - ADA - 标记药物” 的桥联复合物，通过 ELISA 或 ECLIA 检测复合物信号。

表达蛋白的ADA分析示意图

NAb 是 ADA 中具有 “功能性” 的子集 —— 可与溶瘤腺病毒或其表达蛋白结合，直接阻断病毒的溶瘤活性或蛋白的生物功能，因此是评估免疫原性对疗效影响的关键指标。NAb 检测需结合药物作用机制（Mechanism of Action, MoA），遵循 “fit-for-purpose” 原则选择方法。

2.1. 针对溶瘤腺病毒的 NAb 检测

溶瘤腺病毒的 NAb 检测主要采用基于细胞的方法，核心是观察抗体是否抑制病毒在靶细胞中的复制或活性，常用三种方法，各有优劣（见下表）：

• 病毒空斑法：将稀释后的病毒与样本血清共孵育后接种细胞，覆盖琼脂糖抑制病毒扩散，培养 1~2 周后染色计数 “病毒空斑”（病毒复制形成的细胞溶解区）。若样本中存在 NAb，空斑数量会减少，通过空斑抑制率判断 NAb 活性。该方法是病毒滴度检测的 “金标准”，但操作复杂、周期长（1~2 周）、通量低，且结果需人工判读，主观性较强。

• TCID50 法：TCID50（50% 组织培养感染剂量）是指能使 50% 靶细胞发生感染的病毒剂量。将病毒 - 血清混合物与细胞共孵育 72 小时以上，观察细胞病变效应（CPE），通过统计学方法计算 TCID50 值，若 NAb 存在，TCID50 值会升高。该方法无需构建假病毒，但同样存在操作复杂、变异大、通量低的问题。

• Luciferase 报告基因法：先构建携带荧光素酶（Luciferase）基因的重组腺病毒（ADV-luci），将其与样本血清共孵育后感染靶细胞（如 HEK293 细胞）。若样本中存在 NAb，病毒感染会被抑制，荧光素酶表达量降低，通过检测荧光信号强度可量化 NAb 活性。该方法操作简便、周期短（24~48 小时）、通量高，结果客观性强，但需提前构建假病毒，检测试剂成本较高。

此外，细胞活性法（如 MTT 法）、GFP 报告基因法、免疫印迹法等也可用于 NAb 检测，需根据病毒特性、实验室条件综合选择。

2.2 针对病毒表达蛋白的 NAb 检测

与病毒本身的 NAb 检测不同，表达蛋白的 NAb 检测通常采用非细胞方法：将表达蛋白（靶蛋白）与标记后的靶蛋白混合，若样本中存在 NAb，会与两种靶蛋白结合形成复合物，导致游离的标记靶蛋白减少，通过检测游离标记信号的变化，判断 NAb 的中和活性。该方法无需细胞培养，操作更简便，适合高通量检测。

方法学的特殊考量  

• 细胞库管理：基于细胞的检测（如空斑法、TCID50 法）需建立足量的标准化细胞库，细胞复苏后可直接使用或静置培养一段时间，确保细胞状态稳定，避免因细胞活性差异影响检测结果。

• 阴性对照筛选：由于 5 型人腺病毒在中国人群中的预存抗体率高达 70%~80%，常规筛选 10 例未给药个体难以获得合格的阴性对照。临床实验中通常需筛选 200 例以上人血清，从中挑选抗体阴性样本混合，作为阴性对照。

• 稀释液选择：在 ADA/NAb 滴度分析中，可比较阴性对照与稀释液（如 PBS）作为稀释基质的信号差异，通常优先选择 PBS 作为稀释液，减少基质干扰。

• 试剂准备：病毒表达蛋白若为自主制备，需预留足够的制备周期；若购买商用试剂，需提前验证试剂与检测体系的兼容性（如结合活性），确保试剂可用。

   

未来展望 

除了基因工程改造与 “武装化” 设计，溶瘤病毒的未来发展还将在给药技术、联合策略、临床应用范围上实现多维度突破：

在给药技术层面，局部精准给药方案持续优化 —— 针对深部实体瘤的 “影像引导下瘤内注射”“介入导管靶向递送” 等技术，可减少病毒在全身循环中的损耗；“载体包裹递送”（如脂质纳米颗粒包裹病毒）更能直接保护病毒不被血液中的抗体清除，大幅提升药物到达肿瘤部位的效率，解决当前深部肿瘤给药难的问题。

在联合治疗领域，协同策略将成为主流 —— 溶瘤腺病毒与化疗、放疗联合，可通过 “放化疗破坏肿瘤细胞屏障 + 病毒增强溶瘤效应” 提升疗效；与 CAR-T 细胞治疗联合时，病毒溶解肿瘤细胞释放的肿瘤抗原，能为 CAR-T 细胞提供 “靶点信号”，增强其肿瘤杀伤特异性，同时降低单一疗法的剂量依赖性毒性，让治疗更安全、更耐受。

在临床应用拓展上，未来溶瘤腺病毒的适应症将从鼻咽癌、膀胱癌等向肺癌、肝癌、胰腺癌等难治性实体瘤延伸；伴随诊断技术的进步，通过检测患者预存抗体水平、肿瘤微环境特征等生物标志物，可实现 “个体化给药方案” 定制 —— 例如为预存抗体高的患者选择衣壳改造型病毒，为免疫抑制微环境患者选择携带免疫激活基因的病毒，让每一位患者都能获得最适配的治疗方案，真正实现 “精准抗癌” 的终极目标。

参考文献：

1. 《溶瘤病毒类药物临床试验设计指导原则（试行）》 2021.02

2. Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products - Developing and Validating Assay for Anti-Drug Antibody Detection: Guidance for Industry. FDA, 2019.

3.《药物免疫原性研究技术指导原则》, NMPA, 2021.

4. Wang X , Xing M , Zhang C, et al. Neutralizing antibody responses to enterovirus and adenovirus in healthy adults in China[J]. Emerg Microbes Infect, 2014 May;3(5):e30. doi: 10.1038/emi.2014.30.

5. Viruses. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-803109-4.00004-0.

6. Tissue Culture Infectious Dose (TCID50) Assays | BMG LABTECH.

7. Haidar ZS. Oncolytic Viruses: From Basics to Challenges to Innovation[J]. Innov Discov,2024.1(3):27. 

8. Zhou, XL, Hu SF, Wang X. Recent Advances in Oncolytic Virus Combined Immunotherapy in 

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9. Ma NY, Gao J, Pang XA , et al. Formulation-optimized oncolytic viruses: Advancing systemic delivery and immune amplification[J]. J Control Release, 2025, 383:113822. 

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